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    水楊酸對人角質形成細胞絲聚蛋白和激肽釋放酶7表達的影響

    作者:趙丹 指導教師:涂彩霞教授

    2012年5月 大連醫科大學 皮膚病與性病學專業

    一.材料及主要試劑

    (一)細胞系

    人角質形成細胞(HKC)株,購自美國 Cascade Biologics 公司。


    (二)主要試劑及藥品

    1.M154 培養基(美國  Cascade Biologics 公司)

    2.標準胎牛血清(天津 TBD 生物公司)

    3.0.25%胰酶(美國Invitrogen 公司)

    4.溴化四甲基偶氮唑藍(MTT)(美國 Sigma 公司)

    5.二甲基椏楓(DMSO)(美國 Amresco 公司)

    6.水楊酸(香港澳美制藥廠)

    7.人激肽釋放酶 7(KLK7)ELISA 試劑盒(美國cusabio 技術公司) 

    8.兔抗人 FLG 抗體(美國 Santa Cruz 公司)

    9.SP 免疫組化染色試劑盒(北京中衫金橋生物公司)

    10.DAB 酶底物顯色試劑盒(北京中衫金橋生物公司)

    11.Isoplus 總 RNA 提取液(大連 TaKara 寶生物工程有限公司)

    12.逆轉錄-聚合酶鏈反應 RT-PCR 試劑盒(大連 TaKara 寶生物工程有限公司)

    13.引物合成(大連takara  寶生物工程有限公司)

    14.DNA maker(DL5000)(大連 takara  寶生物工程有限公司)

    15.6×loading buffer(大連 takara 寶生物工程有限公司)

    16.瓊脂糖(大連 takara 寶生物工程有限公司)

    17.溴化乙錠(EB)(  美國Amresco 公司)

    18.DEPC 水(大連 takara寶生物工程有限公司)

    19.無水乙醇  氯仿  異丙醇

    二.主要的儀器設備

    1.CO2 細胞孵育箱(美國 Forma Sicentific 公司)

    2.超凈工作臺(  蘇州 SW-CJ-2FD)

    3.低速離心機(北京醫用離心機廠,LDZ5-2)

    4.倒置顯微鏡(日本 Olympus)

    5.普通光學顯微鏡(重慶 COIC 光學儀器廠)

    6.微量移液器(上海精科實業有限公司)

    7.全自動酶標讀數儀(美國BIO-RAD2550)

    8.ΜVP(CA91786)凝膠成像分析系統(美國 GENE 公司) 

    9.高速低溫離心機(  德國 Eppendorf 公司)

    10.PCR 擴增儀(TAKARA 寶生物工程有限公司)

    11.超低溫冰箱(DF-1880,Forma,America)

    三.實驗方法

    (一)細胞的培養

    (二)MTT 法檢測水楊酸對 HKC 細胞生存率的影響

    (三)S-P 免疫組化方法檢測水楊酸對人角質形成細胞中 FLG 表達的影響

    (二)(四)ELISA 方法檢測水楊酸對人角質形成細胞中 KLK7 表達的影響

    (五)RT-PCR 方法檢測水楊酸對人角質形成細胞 KLK7  m RNA 和 FLG m RNA 表達的影響

    結果

    一.水楊酸對 HKC 生存率的影響

    不同濃度水楊酸作用于人角質形成細胞 24h,MTT 法檢測細胞存活率(表 1 和圖1)。2000μg/ml,1000μg/ml 的水楊酸濃度作用人角質形成細胞24h的存活率分別為28.37%和71.16%,與陰性對照組(100%)相比明顯降低(P

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    二.水楊酸對人角質形成細胞中 FLG 蛋白表達的影響

    0.5-500μg/ml水楊酸作用于人角質形成細胞24h后,免疫組化法檢測FLG的表達。500μg/ml,50μg/ml,5μg/ml,0.5μg/ml水楊酸組FLG的表達(1520.476±37.807,3627.906±228.503,1590.677±166.396,808.073±154.108)均明顯高于陰性對照組(563.067±70.144),P<0.01,其中水楊酸濃度為 50μg/ml 時的作用效果最明顯(見圖 2 和圖 3)。

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    圖2水楊酸對人角質形成細胞中FLG表達的影響 A:空白組(PBS代替一抗)B:陰性對照組;C:500μg/ml的水楊酸組;D:50μg/ml 的水楊酸組;E:5μg/ml 的水楊酸組;F:0.5μg/ml 的水楊酸組.四種濃度的水楊酸均可增加人角質形成細胞中FLG的表達水平,其中濃度為50μg/ml的水楊酸促進FLG表達的作用最明顯。 


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    三.水楊酸對人角質形成細胞中 KLK7蛋白表達的影響

    KLK7 標準品按不同濃度(40ng/ml,20ng/ml,10ng/ml,5ng/ml,2.5 ng/ml,1.25ng/ml,0.62ng/ml)稀釋后的標準曲線見圖 4。0.5-500ug/ml 水楊酸作用于人角質 形 成 細 胞 24h 后 , ELISA 法 檢 測KLK7 的 蛋 白 表 達 。與 陰 性 對 照 組(0.2325±0.1516)相比,水楊酸濃度在 500μg/ml,50μg/ml,5μg/ml,0.5μg/ml 時均能抑制人角質形成細胞中 KLK7  蛋白的表達(0.1017±0.01830,0.0787±0.01180, 0.9570±0.19140,0.1120±0.02120,P<0.01),其中 50μg/ml 的水楊酸對人角質形成細胞中 KLK7 表達的抑制作用最明顯(見圖 5)。

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    圖 5.水楊酸對 HKC 細胞中 KLK7 表達的影響, 與不加藥陰性對照相比,“**”表示P<0.01。四種濃度的水楊酸均可抑制人角質形成細胞中 KLK7 的表達水平,其中濃度為 50μg/ml 的水楊酸抑制 KLK7 表達的作用最明顯。


    四.水楊酸對人角質形成細胞中 KLK7mRNA 的表達的影響

    0.5-500ug/ml水楊酸作用于人角質形成細胞24h后,RT-PCR方法檢測KLK7mRNA的表達。與陰性對照組(10570±800.733)相比,濃度為500μg/ml、50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml的水楊酸對人角質形成細胞中KLK7的表達均有抑制作用(分別為9556±512.000,7186±183.567,7571±235.119,8421±211.028 ) , 差 異 有 統 計 學 意 義(P<0.01)。其中水楊酸濃度為 50μg/ml 時對人角質形成細胞中 KLK7mRNA 的表達抑制作用最明顯(見圖 6 和圖 7)。


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    五.水楊酸對人角質形成細胞中 FLG mRNA 的表達的影響

    0.5-500ug/ml 水楊酸作用于人角質形成細胞 24h 后,RT-PCR 方法檢測KLK7 m RNA 的表達。與陰性對照組(7760±74.746)相比,濃度為 500μg/ml,  50μg/ml,5μg/ml,0.5μg/ml 的水楊酸對人角質形成細胞中 FLG  的 m RNA 表達均有促進作用( 13500±1014.193,16308±2034.382,137770 ± 2255.839,11935 ±505.433 ,P<0.01),其中水楊酸濃度為50μg/ml 時對人角質形成細胞中 FLG mRNA 的表達促進作用最明顯(見圖 8 和圖 9)。

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    結論

    1、本實驗通過 ELISA 和 RT-PCR 的方法檢測發現,濃度為 0.5μg/ml-500μg/ml的水楊酸可以促進體外培養人角質形成細胞中 FLG 的蛋白和 m RNA 表達,并且抑制 KLK7 的蛋白和 m RNA 表達水平。其中,水楊酸濃度在 50μg/ml 時作用效果最明顯。

    2、水楊酸可通過上調 FLG 和下調 KLK7 的表達水平,而改善表皮屏障功能,通過這些途徑,可能緩解特應性皮炎患者的皮膚脫屑情況,從而恢復皮膚屏障功能,為水楊酸用于特應性皮炎的治療提供實驗依據。


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